Жюстин Энен начала играть в теннис в 5 лет. С 14 лет начала тренироваться у Карлоса Родригеса. В 1997 году выиграла юниорский «Ролан Гаррос». В 1999 стала профессионалом и выиграла дебютный турнир WTA в Антверпене. В этом же году дебютировала на взрослом «Ролан Гаррос».
2001 год стал годом прорыва в карьере Энен. Жюстин выиграла три титула, вышла в полуфинал «Ролан Гаррос» и финал «Уимблдона», дебютировала на итоговом турнире, где дошла до четвертьфинала. Год Энен закончила на 7 строчке рейтинга WTA.
В 2002 году вышла в четвертьфиналы итогового турнира и «Australian Open», полуфинал «Уимблдона», занесла в актив четыре финала, два из которых выиграла, и закончила сезон уже пятой ракеткой мира.
2003 год стал знаковым в карьере Энен. Бельгийка выиграла первый турнир «Большого шлема» на «Ролан Гаррос», обыграв в финале Ким Клийстерс, затем вышла в полуфиналы «Australian Open» и «Уимблдона», а на «US Open» завоевала второй титул «Большого шлема». Все это в совокупности с четырьмя титулами WTA и полуфиналом итогового турнира сделало Жюстин первой ракеткой мира.
Победив в начале 2004 года на «Australian Open», на старте грунтового сезона Энен испытала серьезные проблемы со здоровьем, связанные с ослаблением иммунной системы, вследствие чего рано снялась с «Ролан Гаррос» и пропустила «Уимблдон». Вернувшись в строй в августе, Жюстин завоевала олимпийское золото в Афинах, обыграв в финале Амели Моресмо, а в полуфинале – отыгравшись со счета 1:5 в решающем сете против Анастасии Мыскиной. Выбыв в четвертом раунде «US Open», Жюстин пропустила остаток сезона, чтобы восстановить здоровье. По итогам года Жюстин опустилась на 8 строчку рейтинга.
В 2005 году Энен пропустила из-за травмы «Australian Open», но затем во второй раз в своей карьере выиграла «Ролан Гаррос». На «Уимблдоне» выбыла в первом же раунде, на «US Open» дошла до четвертого круга. По ходу сезона также выиграла два турнира, но опять пропустила остаток сезона из-за травмы и как следствие закончила сезон на 6 строчке рейтинга.
В 2006 году Жюстин Энен вышла в финалы всех четырех турниров «Большого шлема», но выиграла только «Ролан Гаррос». В решающем поединке «Открытого чемпионата Австралии» и на «Уимблдоне» Жюстин проиграла Амели Моресмо. На «US Open» в финале уступила Марии Шараповой. Победой над Марией Шараповой в полуфинале итогового турнира Жюстин, спустя три года, вернула себе звание первой ракетки мира и впервые победила на итоговом турнире.
В начале 2007 года Жюстин почти не участвовала в турнирах из-за бракоразводного процесса. Так Жюстин пропустила «Australian Open» и временно отдала первую строчку в рейтинге финалистке «Australian Open» Марии Шараповой. Однако в конце марта, из-за неудачного выступления Шараповой в «Индиан-Уэллс», Жюстин вернула первенство в рейтинге себе. На «Ролан Гаррос» Энен в третий раз подряд (и четвертый в карьере) одержала победу. «Уимблдон» закончился для нее полуфиналом, а «US Open» – финалом, где Жюстин победила Светлану Кузнецову. Выиграв итоговый турнир второй раз подряд, Энен оставила за собой первую строчку в рейтинге по итогам сезона.
В 2008 года на «Australian Open» Энен выбыла в четвертьфинале, проиграв будущей победительнице Марии Шараповой. 14 января 2008 года Жюстин отпраздновала сотую неделю в ранге первой ракетки мира.
Энен дебютировала за сборную в 1999 году. В 2001 помогла своей сборной одержать победу на «Кубке Федерации», обыграв в финале сборную России. В 2006 году в финале против итальянок в решающем пятом парном матче Жюстин Энен снялась из-за травмы ноги.
В разные годы неоднократно получала такие награды как «Лучшая теннисистка» по версии WTA и ITF, семикратная победительница турниров «Большого шлема», олимпийская чемпионка Афин, обладательница Кубка Федерации, двукратная победительница итогового турнира Tour Championships.
С 2002 по 2007 год была замужем и носила двойную фамилию Энен-Арденн.
